Endotoksyny bakteryjne są pirogenami pochodzącymi od bakterii Gram-ujemnych. Te endotoksyny znajdują się w błonach zewnętrznych zawierających lipopolisacharydy (LPS). Pirogen w kontakcie z krwią lub płynem mózgowo-rdzeniowym może prowadzić do wzrostu temperatury ciała, wstrząsu septycznego i, w niektórych przypadkach, śmierci. Te endotoksyny wydalane przez bakterie Gram-ujemne są główną przyczyną zanieczyszczenia leku. Endotoksyny są wyjątkowo skuteczne, odporne na ciepło, mogą pokonać sterylizujące filtry membranowe i są obecne tam, gdzie są lub były bakterie. Testy sterylności nie identyfikują dokładnie endotoksyn ze względu na ich charakter chemiczny i ponieważ są one wytwarzane tylko przez bakterie Gram-ujemne. Dlatego test endotoksyny bakteryjnej (BET) przeprowadza się na sterylnych produktach (oficjalnie w farmakopei) i urządzeniach medycznych, które należy wszczepić lub wstrzyknąć do organizmu, aby uniknąć działania antagonistycznego. Efekty te obejmują; Gorączka, aktywacja układu cytokin, niszczenie komórek śródbłonka, przepuszczalność naczyń krwionośnych, które między innymi powodują niskie ciśnienie krwi.
BET wykrywa / ocenia ilościowo niebezpieczne ilości fragmentów ściany komórkowej drobnoustrojów od żywych lub martwych bakterii Gram-ujemnych za pomocą lizatu amebocytów z kraba podkowy. Krab podkowy jest odporny na wnikanie bakterii Gram-ujemnych. Ten lizat stosuje się w teście lizatu amebocytów Limulus (LAL), analizie, która określa ilościowo endotoksynę in vitro. Sposób przeprowadzenia testu pozwala uniknąć zanieczyszczenia endotoksyną w granicach określonych przez Farmakopeę. Istnieją 3 warianty testu LAL:
1. skrzep żelowy, połączenie LAL i endotoksyny (mieszanina reakcyjna), co prowadzi do krzepnięcia;
2. Pomiar zmętnienia, w którym szybkość rozwoju zmętnienia po odszczepieniu endogennego substratu odpowiada stężeniu substratu;
3. Chromogen, koncentrujący się na rozwoju żółtego koloru po odszczepieniu syntetycznego kompleksu peptyd-chromogen, który jest porównywany z mieszaniną reakcyjną na standardowej krzywej.
Ważne jest, aby to sprawdzić przed wykonaniem testu endotoksyny. Czułość lizatu (metoda żel-skrzep), liniowość krzywej standardowej (metody ilościowe) i brak czynników zakłócających. Początkowa szybkość reakcji zależy od stężenia obecnej endotoksyny, pH i temperatury. Reakcja wymaga pewnych dwuwartościowych kationów, białka krzepnięcia i układu enzymów kaskady krzepnięcia, z których wszystkie są dostarczane przez lizat.
3 metody są stosowane do oceny leków do wstrzykiwań, wyrobów medycznych i surowców dla produktu końcowego. W metodzie skrzepu żelowego endotoksyna katalizuje aktywację proenzymu (występującego w LAL) w celu wytworzenia koagulazy. Aktywowana koagulaza hydrolizuje specyficzne wiązania w koagulogenie (białko krzepnięcia występujące w LAL) z wytworzeniem koaguliny. Koagulina przez samosprzężenie tworzy galaretowaty skrzep. Pozytywnym wynikiem jest twardy żel, który pozostaje po inwersji. Wynik ujemny pokazuje brak stałego skrzepu po inwersji. Wyniki należy porównać z próbką referencyjną, kontrolną standardową endotoksyną (CSE). Wszystkie wyroby szklane należy poddać depirogenizacji i przetestować cztery razy.
Metody turbidymetryczne i chromogeniczne to testy fotometryczne, w których stężenie endotoksyny oblicza się na podstawie krzywej standardowej. Metoda turbidymetryczna analizuje czas potrzebny do osiągnięcia z góry określonej absorpcji mieszaniny reakcyjnej lub szybkość rozwoju zmętnienia. Test chromogenny mierzy albo; Szybkość powstawania koloru chromoforu uwalnianego przez chromogenny substrat mieszaniny reakcyjnej lub czas wymagany do osiągnięcia z góry określonej absorpcji mieszaniny reakcyjnej. Oba testy należy przeprowadzić dwukrotnie.
Metoda skrzepu żelowego jest metodą bardziej czułą i dokładną, ma mniej wyników fałszywie dodatnich / ujemnych. Pomimo swojej dokładności nie jest zautomatyzowany, czasochłonny i podlega; inhibitory chemiczne i fizyczne, denaturacja białek i zaburzenia pH. Metody ilościowe można zautomatyzować, a wyniki można łatwo obliczyć. Metody te, choć przyjazne dla użytkownika, można zmienić, badając krew, osocze, albuminę, surowicę i podobne materiały. Obie metody są wrażliwe na nadmierne zmętnienie. Metoda turbidymetryczna wiąże się z licznymi fałszywie dodatnimi wynikami, podczas gdy wiele związków oddziałuje z metodą chromogeniczną iw większości przypadków czyni ją nieskuteczną.
[ff id=”7″]